フラビン蛋白蛍光イメージングからニューロン活動の解析へ

2光子顕微鏡の応用

従来のフラビン蛋白蛍光イメージングの限界

冷却CCDカメラと実体蛍光顕微鏡を使用するフラビン蛋白蛍光イメージングは初心者にも容易にできる実験方法ですが、この方法には一つの限界があります。それは脳活動の全体像は容易に把握しやすいのですが、個々のニューロンの活動は判らないという点です。
 脳生理学の主要な研究手段としてニューロンの発火活動を電気生理学的に記録する方法があり、従って脳生理学の非常に大きな部分がニューロン活動を記録したデータを基に組みたてられています。電気生理学によって得られた知見とフラビン蛋白蛍光イメージングで得られた知見とを直接比較できないということでは、我々の研究を進める上で大きな障害となります。


2光子顕微鏡

  

 一方、丸ごとの動物の脳で、個々のニューロン活動を記録するために2光子顕微鏡という特殊な機器を使用するやり方が徐々に広まってきています。
 2光子顕微鏡とは近赤外線パルスレーザーを用いる走査型顕微鏡で、近赤外線パルスレーザーを対物レンズで集光させると、焦点では空間的かつ時間的な光の圧縮が生じ、光子密度が極めて高くなります。その結果、蛍光分子が近赤外線光子を同時に2個吸収する特殊な過程が生じます。
 本来近赤外線光子はエネルギーが低くて蛍光分子を励起することが出来ませんが、光子2個分のエネルギーが一度に吸収されると、色々な蛍光分子を光らすことができるようになります。
 近赤外線は組織浸透性が高く、また励起が焦点でしか生じないという性質により、2光子顕微鏡は丸ごとの動物において脳表から0.7ミリ程度の深さにあるニューロンまで可視化できます。
 ニューロンが発火するとカルシウム濃度が上昇しますが、この濃度変化を予め蛍光カルシウム指示薬をニューロンに投与しておいたり、GFPベースの蛍光蛋白プローブをニューロンに発現させることで蛍光シグナルに変換し、光学的に記録することができます。


二つの測定法を組み合わせる

それでは、2光子顕微鏡があれば、冷却CCDカメラを用いる従来の方法は不要になるのでしょうか。全くそんなことはありません。2光子顕微鏡はかなり高額な機器であり、さらに形態解析だけならともかく、脳機能イメージングに応用するとなると、かなり使い手を選ぶ機器なのです。我々は、全体像が掴みやすいという冷却CCDカメラのメリットと、個々のニューロン活動まで判るという2光子顕微鏡のメリットの両方をうまく生かすために、二つの測定法を組み合わせるのが良いのではないかと思っています。
 幸いなことに新潟大学脳研究所にも平成21年度の補正予算で2光子顕微鏡が導入され、私たちも日常的に使うことができるようになりました。折角のチャンスをうまく生かし、脳活動の全体像から個々のニューロン活動までもれなく調べ上げることができる脳機能イメージングシステムを作り上げました。
 二つの測定法のメリットを生かし、既に複数の仕事を成功させております(論文リスト:Honma et al., 2013; Yoshitake et al., 2013; Tohmi et al., 2014; Tsukano et al., 2015参照)。



動画(2光子顕微鏡で撮影した、マウス一次視覚野のカルシウム濃度変化) へのリンク

スケールバーは50ミクロン。疑似カラースケールは+−50%の強度変化に相当。カルシウム指示薬はフルオロ4を使用。変化幅が大きいので単一試行でニューロン細胞体の反応が分離できる。



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